从诞生到现在，显微镜已经成为各个研究领域的实用工具，为疾病研究和材料检测提供了有力的帮助。在显微镜下，标本并不总是很容易观察。研究未染色的细菌、薄组织切片、活细胞等低对比度标本，如果改变观察方法，往往可以解决问题。

　　但是你知道吗?常见的显微镜观察方法多达七种(使用的材料有五种)。接下来周口蔡司君老师就给大家讲解一下不同的方法在哪里，应该如何选择。

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　　明场 (BF)

　　明场成像是最常用的显微镜观察方法，也是观察生物样品和材料样品最常用的观察方法。您在显微镜下看到的个明场图像是什么?应该是生物课透射明场下紫洋葱的表皮细胞!

　　生物研究中常用的免疫组化染色也是明场成像。根据不同的标注方式，样品会呈现不同的颜色。抗体标记或染料也可用于区分不同的成分。

　　在下面的 HE 中，细胞核被标记为蓝色，细胞质被染为粉红色。

　　▲HE染色和TMA标本中的DAB染色

　　这种方法简单、有效且成本低。但由于标记成分数量有限，应用范围不广，对比不明显，无法判断阳性结果。

　　观察不透明材料样品，反射明场是最常用的观察方法。光源直接照射样品表面，表面结构对照射光进行不同程度的反射和吸收。图像的亮度反映了样品表面的粗糙度和吸光率。

　　下图是反射明场观察法的结构和明场中纯铝的图像。通过明场图像，可以清楚地获得纯铝晶粒的大小和形状。

　　▲反射明场结构示意图

　　▲ 纯铝明场图像

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　　暗场 (DF)

　　暗场成像对应于明场成像。顾名思义，人们并不直接观察照明光，而是将光斜射在试样表面。根据廷德尔现象，粒子反射或衍射斜光，增加只有人眼的可见度，我们才能观察到极小的物体。

　　▲透射暗场成像光路原理

　　那么如何实现暗场成像呢?通过显微镜的横截面图，我们可以看到聚光镜将一束光以一定的高度角对准标本上，使部分光线不会直接进入物镜。穿过样品的光线被光学不连续性(如细胞膜、细胞核和内部细胞器)衍射、反射和折射，然后再次进入物镜，然后样品在黑色上可以被看作是一个明亮的物体背景。

　　泽斯先生，通过几张图，带你了解暗场中的微观世界。

　　▲ 透射暗场观察到的标本图像：水蚤、寄生虫、水蜗牛、花粉粒

　　一般来说，暗场适合观察微小颗粒、细菌形态、细菌数量、透明标本等，可以看到标本的精细结构。

　　不幸的是，物体散射的光会影响成像，从而降低对比度并模糊标本的细节。同时，试样中的灰尘和碎屑也会对生成的图像产生影响。

　　此外，较薄的贴壁细胞通常信号较弱，而较厚的植物和动物组织会将过多的光线重定向到物镜中，这会降低成像的对比度，因此暗场成像需要更高的标本。 .

　　观察材料样品的暗场结构与生物的暗场结构略有不同(见左下图)。反射光暗场可反射样品表面的超细结构，可观察到小至0.004um的结构。然而，由于微小结构的光散射或衍射，在暗场中无法进行准确的测量，因此暗场仅适用于观察，用于一些超细结构和缺陷的定位。当然，反射光暗场还有一个小用途，可以得到透明或半透明材料的颜色，比如PCB板的绿油、锈色等。